RIPK1（受体相互作用蛋白激酶1）作为死亡信号调控的关键因子，已成为近期研究的热点。有意思的是，它就像一个“双面人”。一方面，RIPK1作为支架促进MAPK和NF-κB通路的激活，并抑制细胞凋亡和坏死性凋亡。另一方面，它作为激酶又反常地诱导细胞凋亡和坏死性凋亡。RIPK1如何在这双面角色中自由切换，目前还不大清楚。

近日，比利时VIB炎症研究中心领导的研究团队发现，IKKα/β介导了RIPK1第25位丝氨酸（Ser25）的磷酸化。它作为一种 “分子刹车”，直接抑制RIPK1的激酶活性，并阻止TNF介导的RIPK1激酶依赖性细胞死亡。

在4月份的《Nature Communications》杂志上，研究人员报道了这种精确的分子机制，让RIPK1在促生存和促死亡功能之间自由转换，并证明了其在小鼠感染和炎症模型中的生理相关性。

RIPK1上的Ser25位点被磷酸化

之前的研究表明，RIPK1是IKKα 和IKKβ 的直接底物。于是，研究人员从野生型和Ikkα/β^−/−小鼠胚胎成纤维细胞中分离出TNFR1复合物I，并开展LC-MS/MS质谱分析，以鉴定出RIPK1上的磷酸化残基。他们发现，在缺乏IKKα/β 的情况下，RIPK1上Ser6和Ser25的磷酸化大大降低。结合之前的研究成果，他们证实RIPK1上的Ser25位点被直接磷酸化。

模拟Ser25磷酸化避免TNF诱导的细胞死亡

为了确认IKKα/β介导的pS25 RIPK1的生理相关性，研究人员委托赛业生物（Cyagen）利用CRISPR/Cas9技术产生了模拟磷酸化的S25D RIPK1敲入小鼠品系。Ripk1^S25D/S25D小鼠是健康的，且RIPK1表达水平与Ripk1^+/+小鼠无差别，表明s25d突变对ripk 1的稳定性没有影响。

他们从这些小鼠身上分离出骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）和小鼠成纤维细胞（MEF），然后开展实验。他们发现，在不存在或存在caspase抑制剂（zVAD）的情况下，用S25D突变来恢复pS25 RIPK1极大保护了BMDM和MEF，使它们免受TNF诱导的RIPK1激酶依赖性细胞凋亡和坏死性凋亡（图1）。

研究人员之前发现，将IKKi与亚致死剂量的TNF一起给药会导致小鼠体温过低和死亡。值得注意的是，Ripk1^S25D/+和Ripk1^S25D/S25D小鼠能够躲过这种致命的攻击。在没有IKKi的情况下，注射致死剂量的TNF，这些小鼠也同样受到保护。总之，这些结果强调了IKKα/β介导的pS25 RIPK1在体外和体内都具有重要保护作用，能够避免TNF诱导的细胞死亡。

图1. 模拟Ser25磷酸化避免TNF诱导的细胞死亡

Ser25磷酸化调节了Yersinia感染后的免疫反应

Yersinia感染小鼠是一种常用的模型。在耶尔森菌属Yersinia感染细胞后，毒力蛋白YopJ/P抑制了IKK和TAK1的催化活性，试图通过阻止促炎症介质的表达来逃避宿主防御。为了应对这种劫持，RIPK1激酶依赖性细胞凋亡已成为一种备用机制，以帮助宿主细胞应对感染。

研究人员分析后发现，在Y. enterocolitica（表达YopP）和Y. pseudotuberculosis（表达YopJ）感染细胞后，模拟pS25 RIPK1的BMDM能够免受YopJ/P依赖性细胞凋亡。在Ripk1^S25D/S25D BMDM中观察到的保护作用与药理上或遗传上抑制RIPK1激酶活性的效果相当。这些结果表明，YopP/J对RIPK1 Ser25磷酸化的抑制激活了应对Yersinia感染的备用机制，也就是RIPK1激酶依赖性细胞死亡。

Ser25磷酸化缺陷导致多器官炎症

在另一种SHARPIN缺陷型小鼠模型中，RIPK1激酶依赖性细胞死亡却发挥着有害作用。小鼠慢性增生性皮炎（cpdm）是一种因缺乏SHARPIN表达而出现的多器官炎性疾病，它诱导了TNF/TNFR1介导的RIPK1激酶依赖性细胞凋亡或坏死性凋亡。

鉴于SHARPIN在IKKα/β激活中起作用，研究人员从SHARPIN缺陷型小鼠（Shpn^{cpdm / cpdm}）中分离出小鼠皮肤成纤维细胞（MDF），发现TNF诱导的pS25 RIPK1存在缺陷。之后，他们用S25D突变来恢复Ser25磷酸化，发现这能够保护细胞免受TNF诱导的细胞凋亡。更重要的是，将Ripk1^{S25D / S25D}小鼠与Shpn^{cpdm / cpdm}小鼠杂交完全拯救了后者的多器官炎症表型（图2）。

图2. Ser25磷酸化缺陷导致多器官炎症

Ser25磷酸化直接抑制了RIPK1催化活性

研究人员通过结构分析发现，Ser25位于RIPK1 β1-β2发夹内的激酶结构域，紧邻着ATP结合位点中的富含甘氨酸环，这是蛋白激酶中最保守的motif之一。他们预计Ser25的磷酸化会影响核苷酸结合。利用重组RIPK1开展激酶分析后，他们发现S25D模拟磷酸化突变极大地影响了RIPK1的激酶活性。因此，在细胞表面受体结合期间，Ser25的磷酸化似乎直接抑制了RIPK1的催化活性（图3）。

图3. Ser25磷酸化直接抑制了RIPK1催化活性

研究人员在文中总结道：“在本研究中，我们揭示了IKKα/β对RIPK1上Ser25的磷酸化作为分子刹车，直接抑制了RIPK1的激酶活性，这有助于了解对炎性细胞死亡的调控，并有望成为药理学干预的靶点。”

原文检索

Serine 25 phosphorylation inhibits RIPK1 kinase-dependent cell death in models of infection and inflammation

Nature Communications 10, Article number: 1729 (2019)